關(guān)于培養(yǎng)細(xì)胞樣品:
1.融解ripa裂解液,混勻。取恰當(dāng)量的裂解液,在運用前數(shù)分鐘內(nèi)參加pmsf,使pmsf的終濃度為1mm。
2.關(guān)于貼壁細(xì)胞:去除培養(yǎng)液,用pbs、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍(假如血清中的蛋白沒有干擾,能夠不洗)。按照6孔板每孔參加150-250微升裂解液的份額參加裂解液。用槍吹打數(shù)下,使裂解液和細(xì)胞充沛接觸。一般裂解液接觸細(xì)胞1-2秒后,細(xì)胞就會被裂解。
關(guān)于懸浮細(xì)胞:離心收集細(xì)胞,用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6孔板每孔細(xì)胞參加150-250微升裂解液的份額參加裂解液。再用手指輕彈以充沛裂解細(xì)胞。充沛裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉積。假如細(xì)胞量較多,必需分裝成50-100萬細(xì)胞/管,然后再裂解。
3.充沛裂解后,10000-14000g離心3-5分鐘,取上清,即可進(jìn)行后續(xù)的page、western和免疫沉積等操作。
裂解液用量說明:一般6孔板每孔細(xì)胞參加150微升裂解液現(xiàn)已足夠,但假如細(xì)胞密度十分高能夠恰當(dāng)加大裂解液的用量到200微升或250微升。
關(guān)于安排樣品:
1.把安排剪切成細(xì)微的碎片。
2.融解ripa裂解液,混勻。取恰當(dāng)量的裂解液,在運用前數(shù)分鐘內(nèi)參加pmsf,使pmsf的終濃度為1mm。
3.按照每20毫克安排參加150-250微升裂解液的份額參加裂解液。(假如裂解不充沛能夠恰當(dāng)增加更多的裂解液,假如需求高濃度的蛋白樣品,能夠恰當(dāng)減少裂解液的用量。)
4.用玻璃勻漿器勻漿,直至充沛裂解。
5.充沛裂解后,10000-14000g離心3-5分鐘,取上清,即可進(jìn)行后續(xù)的page、western和免疫沉積等操作。
6.假如安排樣品本身十分細(xì)微,能夠恰當(dāng)剪切后直接參加裂解液裂解,通過激烈vortex使樣品裂解充沛。然后同樣離心取上清,用于后續(xù)試驗。直接裂解的優(yōu)點是比較方便,不用運用勻漿器,缺陷是不如運用勻漿器那樣裂解得比較充沛。
注:ripa裂解液的裂解產(chǎn)品中經(jīng)常會出現(xiàn)一小團通明膠狀物,屬正常現(xiàn)象。該通明膠狀物為含有基因組dna等的復(fù)合物。在不檢測和基因組dna結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下,能夠直接離心取上清用于后續(xù)試驗;假如需求檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白,則能夠通過超聲處理打碎打散該通明膠狀物,隨后離心取上清用于后續(xù)試驗。假如檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄因子,例如nf-kappab、p53等時,一般不用進(jìn)行超聲處理,就能夠檢測到這些轉(zhuǎn)錄因子。