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在細胞培養過程中,經常少不了HEPES緩沖液。那么,HEPES緩沖液的配制和使用方法怎樣呢?HEPES緩沖液是一種弱勢,在開放式的培養條件中,若加入HEPES,可防止培養基內pH氧化升高,從而將PH維持在7.0左右。
HEPES分子量為238.31,化學名:哌嗪磺酸,分子式: C8H18N2O4S。
HEPES常用于生物緩沖劑,pH值緩沖范圍:6.8-8.2,用在生化診斷試劑盒、DNA/RNA提取試劑盒及PCR診斷試劑盒里。對細胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑,能較長時間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50mmol/L。
關于HEPES 緩沖溶液的配制,不同的文獻資料有不同的說法。根據用途,一種是單純的HEPES+NaOH,另一種是HEPES+鹽。各種配制方法總結如下:
一、500ml 1 M HEPES, pH = 7.0 Stock solution的配制
119.15 g HEPES 溶解在400ml蒸餾水中,加0.5~1M 的NaOH水溶液調節至少所需pH(HEPES的有效pH 范圍是6.8~8.2),然后用蒸餾水定容至500ml,于4攝氏度保存。
二、加少量鹽的HEPES Buffer配方(500ml)
HEPES 6.5g、NaCl 8.0g、Na2HPO4.7H2O 0.198g、用0.5M NaOH 水溶液調節pH值,zui后定容。
三、2×HEPES緩沖鹽溶液的配制
將1.6g NaCl、0.074g KCl、0.027g Na2HPO4.2H2O、0.2g葡聚糖(glucan or dextran)和1g HEPES溶解在90ml的蒸餾水,用0.5M NaOH調節至所需pH值,再用蒸餾水定容至100ml即可。
HEPES使用方法有兩種:
(1)HEPES可按所需的濃度直接加入到配制的培養液中,再過濾除菌。每1000ml培養液中加入2.38克HEPES,待溶后用lN NaOH 調pH至7.2,濾過除菌后使用。此時HEPES的使用濃度為10 mmol/L。
(2)亦可配成 100 x 貯存液(l mol/L),使用前取 99ml培養液加入 lml貯存液,zui終應用濃度仍為10mmol/L。l mol/L(100 x)HEPES貯存液配制方法:取23.8g HEPES溶于90ml雙蒸水中,用lN NaOH調pH至7.5一8.0,然后用水定容至100ml,過濾除菌,分裝小瓶(2ml/瓶),4℃或-20℃保存。
需要注意的是,HEPES緩沖液的使用終濃度為10-50mmol/L,對細胞無毒性作用。一般情況下,濃度為20mmol/L的HEPES即可達到緩沖能力。現在市售HEPES為約10g包裝的小瓶,大家根據實際情況正確靈活配制就OK了。